磁场控制技术在微流控中的应用

eva1

微流控技术发展至今，已经在包括细胞操控分析、医学诊断、生物学研究等多个领域显示了较好的应用前景。作为在微米尺度结构中操控流体的驱动力，磁场具有电场和流体动力所不具备的优势。磁场力的大小不受通道表面电荷、溶液pH值、离子强度和温度等条件的限制，而且磁场可以不与通道内的物质直接接触而实现控制，极大降低了交叉污染的可能。由于磁性粒子与周围介质之间的磁化率有很大差别，因此，利用磁场可以将其方便地与周围介质分离，这一特性使其在微流控芯片分离富集方面的优势显得尤为突出。随着微电子机械系统(micro electromechanical system， MEMS)技术的进步，在微流控芯片中加工微尺度甚至阵列电磁线圈和磁体成为可能，因此，磁场控制技术在微流控系统中具有非常广阔的应用空间。该技术在近两年发展非常迅速，尤其在免疫分析、病原体检测和分子诊断等领域的应用独具优势，在本文中，我们将对这一领域的最新进展做一介绍。

加工技术

微流控芯片系统中的磁场控制一般通过外加磁场、加工集成永磁体或电磁体等方式对微通道中磁性粒子进行有效操纵来实现。磁性粒子所受到的磁场力可以用式表示：

其中，Δχ是磁性粒子与周围溶液或介质的磁化率差，V是粒子的体积，μ0为真空磁导率， B 是磁感应强度，∇B 为磁场梯度。对于均匀磁场来说，∇B为0，此时，粒子在磁场中只能被磁化，而不会受力发生移动。所以，磁性粒子只有在不均匀的磁场中才能够发生受力运动，而磁感应强度B 在磁场方向随距离增加是呈指数递减的。因此，通常为了对微通道中的磁性粒子进行精确地操纵和定位，需要磁场尽量接近微通道。无论永磁体还是电磁体，通过提高磁感应强度来得到最大磁场力的努力总是受到材料和现有技术水平的限制，一个简单有效的办法就是缩小磁场区域，即提高磁场梯度∇B。对于微流控芯片来说，磁场的尺寸和形状要尽量与微米级的芯片通道相匹配，于是，基于MEMS技术的集成磁控器件的加工技术一直备受关注。在芯片上加工电磁线圈一般都需要经过多次光刻和电镀程序。图显示了一种电磁线圈的加工过程，采用光刻技术在玻璃表面制作出金属线圈、导线和绝缘层等微结构单元，控制每层金属薄膜的尺寸和形状，一般在电镀之前均要沉积一层金属作为种子层，金属层之间通过SU28光胶或聚酰亚胺进行绝缘。Ra2madan等还发现，在电磁线圈中间加工软铁芯，可以大大提高磁场梯度，有利于对磁性粒子的操控，与单纯电磁线圈相比，磁场力可提高20倍。

集成磁体的微流控系统可以得到微型化的精准磁场，但是加工工艺过于复杂，不易实现。针对这一问题，Whitesides等报道了一种在聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane， PDMS)芯片中加工微米级电磁体的简单方法，即采用软光刻方法先在PDMS芯片中加工出微通道，然后灌注液体焊锡，冷却通电即可产生必要的电磁场。Lin等采用类似方法在侧通道中充入并固定金属镍的磁性微球，在与其仅距25μm的分离通道中形成较强的磁场梯度，实现对磁珠的分离。此外，与芯片集成化磁体相比，采用施加外加磁场的方法通常可以得到同样有效的磁场作用，而且，具有易于加工和低成本的优势，因此，这类方法在磁控微流控系统中的应用非常广泛。
  
流体控制

泵阀
通过泵阀来控制流体是除了分离外，磁场在微流控芯片系统中的另一个主要功能，其中泵主要有磁流体动力(magnetohydrodynamic， MHD)泵，铁磁流体( ferrofluidic)泵和蠕动泵等。MHD泵是利用施加正交的磁场和电场产生的洛伦兹力来驱动液流，适用于任何导电的液体，是较早使用的一种磁驱动模式。但MHD泵在工作时溶液经常会因电解而产生气泡，影响正常的驱动和分析操作。Arumugam等通过在溶液中加入氧化还原剂，减少了气泡的产生，并延长了电极的使用寿命，而且这种泵需要的电压比普通直流MHD泵低，水性和非水性的溶液都可以被驱动。与MHD 泵相比，铁磁流体驱动只需施加磁场而不需电场，因此系统更加简单。铁磁流体是磁性粒子在水溶液或者有机溶液中形成的稳定悬浊液，同时具有磁性和流动性。其中，铁磁流体溶液与所运输溶液必须是不互溶的，因此，当输运对象为水溶液时，磁性粒子必须分散在油性溶液中，而微通道表面亲疏水性质也会在很大程度上影响铁磁流体泵的性能。Yobas等还设计了一种旋转的磁控芯片系统，利用磁场带动不锈钢滚珠在轨道上滚动挤压PDMS通道，巧妙地实现了蠕动泵的驱动功能。此外，还有阻抗泵、气体泵、微齿轮泵以及利用集成二极管与交变电场相互作用来实现驱动的磁微流体装置等。

对于流体动力驱动的微流控芯片系统来说，加工有效的微阀结构也是至关重要的，除了Quake课题组早年提出的气动阀外，利用磁场控制微通道的闭合和开启也可以方便地进行试剂/样品的切换，实现阀的功能，结构更为简单灵活。

混合
微米尺度条件下流体通常是层流状态，因此，在微通道中如何进行有效混合一直是科学工作者们感兴趣的课题。解决的方法之一就是通过MEMS加工技术将磁子安置在微通道内，利用磁场带动磁子转动以达到高效混合的目的。但是，三维加工技术难度较大，不利于普及应用。Nallani等报道了一种倾斜曝光方法，用于加工三维的铁磁性微转子。他们利用空气和SU28折射率不同，让紫外光以55°角入射，得到倾斜角为31.6°的SU28模具。然后将铁镍合金注入制成具有三维结构的磁性转子，该转子转动时可引起液流的三维扰动，实现微尺度下的快速混合。

与加工磁子相比，利用磁珠的运动形成不规则流体是一种简单有效的进行混合的方法。Hu等通过改变外加磁场频率使液滴中的磁珠扰动并形成不同形式的涡流，从而实现液滴的快速高效混合。Oh等则利用侧通道中一段铁磁流塞的往复运动诱导主通道中流体产生扰动，来进行有效地混合。
  
操控

磁珠/细胞的操纵
在微流控芯片系统中对细胞或体积更小的病毒颗粒甚至单分子进行精确地操纵一直是科学家们竞相研究的热点，磁控芯片系统可以方便地通过磁珠捕获目标分子，再利用磁场进行精确控制。

为了降低电磁场所需电流并形成有效的磁场梯度，Wang等在芯片上制作了4条铜导线，并将整个芯片置于永磁铁上，通过控制铜线电流可以选择性地操控单个磁珠。Latham等则通过外加磁场实现纳米磁珠在双层正交微通道间的连续切换进样，进样量和速度均可控制。

一些细胞具有天然的磁性，如红细胞、白细胞等，因此利用磁控芯片系统可直接对其进行操纵。Krichevsky等将磁带的磁头进行改进，利用其在空间产生的高梯度磁场来捕获和分选磁性细菌，并利用内置的自旋阀传感器进行检测。对于大部分本身不具有磁性的细胞，可以将其吸附到功能化的磁珠表面后进行操控。Koschwanez等在PDMS芯片上直接沉积锥形结构的镍钴硼合金，在外界小型永磁体的作用下磁化，可捕获单个酵母细胞。Lee等在微流控芯片上加工由一系列微线圈构成的集成电路，可快速调整磁场强度和模式，同时控制多个细胞。此外， Chiou等还利用微流控芯片集成电磁线圈实现对单个DNA分子的拉伸和旋转等操作。

液滴的操控
近年来发展起来的微液滴技术具有样品消耗少、低污染、混合快等优点，是一种理想的微反应器。利用磁场可以在油相或超疏水的表面操控含有磁性物质的液滴，通过施加外磁场可以方便地控制液滴移动，依次完成运输、混合、反应及在不同温区间往复移动等操作。Lehmann等利用印刷电路板(p rinted circuit board，PCB)加工成微线圈，如图所示，他们在微线圈上面涂覆一层局部亲水的疏水Teflon膜，于是可以在Teflon表面形成固定位点的水溶液滴，这些液滴分别含有细胞裂解液、杂交液和洗脱液等成分。接着，通过二维磁场控制含有磁性微球的液滴依次经过这些液滴，完成吸附、清洗和洗脱等步骤，实现核酸提取和酶反应等操作。

Wang等利用磁场和电润湿作用对液滴中的磁珠进行富集和分离，效率可以达到90%以上。Haguet等甚至可以对悬浮液滴进行操纵，含有反磁性物质的液滴在永磁体微槽中，可以悬浮在空气中，并沿着轴向，在垂直交叉的槽内移动。利用磁场对液滴进行操控具有选择性强、方便灵活等特点，因此，这一方法可能成为微液滴操纵的一个有效的手段，而高集成度的微电磁线圈阵列则可能成为构建高通量微液滴反应器的基本平台。

磁分离

磁珠/细胞分离
使磁场与微通道的距离尽量缩短以及形成尽可能大的磁场梯度是得到足够磁场力对粒子进行操控的最有效手段，因此，对于外加磁场的微流控系统来说，通常需要将磁体集成到芯片上，以尽可能接近微分离通道。芯片集成电磁线圈通常由于功率限制不能够施加很高的电流，磁力比较弱，有时还需要外加磁场的辅助。针对上述问题， Xia等在芯片主通道一侧电镀NiFe层，可产生高梯度磁场，该芯片通道为Y型，当磁珠标记的细胞从离磁场较远处的进口引入时，细胞就会由于磁场作用而偏离原来的方向，从另一个出口流出，得到有效的分离。Kim等和Shih等也采用了类似的芯片设计，分别用于分离凋亡T淋巴细胞和病毒颗粒。Liu等通过精确控制磁场的频率，对不同直径的磁珠进行了分离。Qu等则利用红细胞和白细胞本身的顺磁性和反磁性，分离了全血中的这两种细胞。

核酸提取
利用磁性微球表面修饰特定的功能化基团分离核酸、蛋白质等生物大分子的技术已经发展得相当成熟，并得到了非常广泛的应用。因此，这一技术也被诸多课题组用于微流控芯片中提取微量核酸样品。微流控芯片上进行DNA提取一般先将细胞破膜，释放出的DNA被吸附在功能化的磁珠表面，再利用外界磁场将磁珠固定，细胞膜及其他物质都被清洗液冲走，最后将DNA洗脱进行PCR 扩增等操作。

Lee等设计了简单的单通道芯片结构，使用808nm激光束使细胞快速破膜，然后用磁珠捕获了包括E. coli在内的几种病原体。此后，他们还设计了集成化的病原体检测芯片，在CD 光盘上仅用12 min即完成了全血中特异病原体基因的提取。Nakagawa等使用改性的细菌磁性微球提取全血中的DNA， 5μl的全血可以提取165 ng DNA，洗脱约100 ng，萃取效率为60.6%。Dubus等利用磁珠连接的探针与目标DNA配对成双链，再利用一种富含正电荷的荧光高聚物与双链DNA发生静电作用，从而对目标DNA进行了分离和高灵敏度检测，检出限可以达到200拷贝/150μl，与采用PCR扩增方法的水平接近。

利用微流控芯片进行核酸提取，需要的细胞数量较少，而且降低了污染，有利于对稀有细胞进行分选和分析。

应用

如前所述，表面功能化的磁珠作为固相载体，可以用来有效地捕获核酸、蛋白分子、病毒颗粒甚至细胞，已经被广泛地应用于各种生化指标的临床诊断等领域。而微流控芯片系统具有快速、高效、集成化等特点，两者结合，有望实现临床检测仪器进一步便携化和微型化，甚至将临床诊断技术带入现场诊断(point-of-care testing， POCT)的时代。

免疫分析
免疫分析是临床上常用的检测方法，磁控免疫芯片系统一般采用非均相免疫体系，以包被了抗体或抗原的微米或纳米磁珠为载体，在微通道中固定这些磁珠以捕获抗原或抗体。采用微流控芯片系统显著改善了常规免疫分析的速度和性能，大大降低了成本和试剂的消耗，一些系统在POCT领域显示了广阔的应用前景。磁控免疫芯片的检测系统也从激光诱导荧光检测发展到电化学传感器，无需进行荧光标记，系统体积可进一步减小，有利于实现便携化。

此外， Herrmann等设计了双通道芯片网络，免疫复合物形成与酶反应在不同通道中进行，减少了非特异性吸附，降低了背景噪声，从而将检测限降低到100 pg/ml水平。Morozov等则将电场和磁场相结合，来提高系统灵敏度。他们首先利用电泳，使得溶液中的抗原与固定在通道侧壁的抗体充分结合，再加入表面功能化的磁珠与抗原结合，利用光学显微镜检测，最低可以检测到10^-17 mol/L的链霉亲和素。

实现生化分析的现场化和高通量一直是临床检测的发展目标， Tang等设计了4种不同抗体的电极，可以同时测定甲胎蛋白(AFP)等4种肿瘤标志物。Lacharme等则通过降低磁场偶极能量使得磁珠在微通道中进行自组装，形成有序的阵列结构，以进行免疫分析。

病原体检测
与免疫分析芯片一样，便携式高通量病原体检测芯片将成为未来应付大规模突发性公共卫生事件的有力工具之一。Pipper等设计了通过磁场操纵液滴来完成捕获、释放、混合、反应、检测等步骤，对高致病H5N1禽流感病毒进行了实时定量RT-PCR检测，与传统方法相比灵敏度提高4倍，成本降低至少20倍。Lee等设计了一系列集成磁控芯片系统，通过连接在磁珠上的抗体识别并捕获病毒分子，释放其中RNA，进行反转录PCR，完成对登革热病原体的离线检测。

蛋白组学
磁控微流控芯片的另一个应用是用于蛋白质的高效酶解。用包被有褐藻酸的磁珠固定胰蛋白酶，在芯片上消化蛋白质，可获得很高的效率，Viovy课题组在这方面做了一系列研究工作。他们在微通道的两侧放置磁铁，与通道呈30°夹角，使磁力线方向与液流方向平行，表面固定胰蛋白酶的磁珠引入后在磁场作用下会在通道内自组装成填充柱结构，随后引入样品进行酶解。此外， Li等建立了利用功能化磁珠固定胰蛋白酶的芯片酶反应器-MALD I-TOF质谱系统，为更加深入的蛋白组学研究提供了有力的工具。

核磁共振
核磁共振(NMR)是进行分子结构鉴定的有效工具之一，近年来微型核磁线圈探头的发展使得NMR检测的灵敏度又有了显著的提高。Lin等提出一种基于微液滴的NMR检测技术，采用纳升级分流器可以收集98%的液相色谱仪流分用于NMR检测，而另外2%用于质谱分析，与常规系统相比灵敏度和进样效率均有大幅提高。通过合理设计，微流控芯片还可以作为化学反应过程分析的理想工具。Takahashi等设计了微流控芯片NMR检测系统的接口，可以方便地用于实时监控化学反应的中间产物。Pines等将远程NMR检测方法用于监控非平衡化学反应过程中反应单体与产物之间的自旋相干转移，可以给出更多有关反应机理的信息。随后，他们将原子磁力计集成到微流控芯片上，并在零磁场区域进行NMR检测，检测器外无需安置螺线管，样品与检测器更加接近，灵敏度显著提高。

值得一提的是，不久前Lee等报道了一套完全微型化的NMR芯片系统，包括阵列微流控芯片、集成线圈、NMR电路和经过简化的微型永磁体，整个装置可以放进上衣口袋。该系统可以同时检测5-10 μl样品中的8种指标，并被成功用于病毒、细胞和疾病标志物的检测。


综上所述，磁场控制技术应用到微流控系统中为后者开辟了更为广泛的发展空间，提高了微流控系统对各种物质进行操控的能力，甚至可以实现单细胞或单分子的捕获和控制，同时，也提高了系统的集成化程度。磁场控制技术在微流控芯片系统中的应用将会在以下几个方向有更广阔的发展前景。首先，磁场所具有的独特分离能力已经在传统样品处理过程中显示了强大的优势，与微流控芯片技术的结合，使得整个系统可以处理更少的样品量，对于稀有标本或临床检测具有重要意义;其次，微型化的电磁线圈对于单个细胞甚至分子具有更高的分辨能力，可以进行单细胞或亚细胞器的分离、提纯及其分析;目前，磁珠表面功能化技术日臻成熟，将其应用于微流控芯片技术中，通过在各个微结构中固定具有不同基团的磁珠，可实现快速、集成、高通量的样品处理、分离及检测分析等。

当前，磁场控制微流控芯片系统也面临一些亟待解决的问题：
(1)如何通过集成电磁线圈程序化地控制磁珠精确定位和移动方向及速度，还有待深入研究；
(2)现有的磁控微流控芯片对样本的处理通量仍然较低，不能够满足大规模临床检测的需求，因此如何提高芯片单次处理样本的数量也是将来努力的方向；
( 3)如何改善现有集成电磁线圈加工工艺，制作具有更高磁场梯度和强度的微磁体，加强工艺标准化和系统稳定性的问题，对未来的产业化发展也具有重要的意义。
总而言之，对于多数系统来讲，微型化、自动化和高通量仍然是将来发展的一个重要方向，生物分析包括临床诊断和现场检测将成为磁控微流控系统发展的重要突破;此外，在蛋白组学、细胞分析等领域也将有较大的发展前景。




文章来源：微信公众号   融创芯城（一站式电子元器件购买服务平台，项目众包平台）